PT - JOURNAL ARTICLE
AU - Шишкова, Д. К.
AU - Синицкая, А. В.
AU - Синицкий, М. Ю.
AU - Матвеева, В. Г.
AU - Великанова, Е. А.
AU - Маркова, В. Е.
AU - Кутихин, А. Г.
TI - Случай спонтанного эндотелиально-мезенхимального перехода в культуре первичных эндотелиальных клеток пупочной вены человека
DP - 2023-01-16
TA - Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний
4100 - 10.17802/2306-1278-2022-11-3-97-114
SO - https://www.cardiojournal.online/publication/5400
AB - Основные положения. Спонтанный эндотелиально-мезенхимальный переход первичных эндотелиальных клеток пупочной вены человека характеризуется многократным повышением уровня экспрессии генов транскрипционных факторов SNAI2 и TWIST1, полной потерей экспрессии маркеров и транскрипционных факторов эндотелиальной дифференцировки (CD31/PECAM1, VE-кадгерина, транскрипционного фактора ERG), ярко выраженной экспрессией генов маркеров мезенхимальной дифференцировки (фибробласт-специфичного белка и альфа-актина гладких мышц) и выраженным синтезом основного компонента внеклеточного матрикса коллагена I типа. Оптимальным алгоритмом определения эндотелиально-мезенхимального перехода является определение транскрипции генов эндотелиальной дифференцировки (PECAM1, CDH5, VWF, ERG), генов транскрипционных факторов SNAI2 и TWIST1, генов мезенхимальной дифференцировки (FAP, S100A4, ACTA2) и генов маркеров активности синтеза компонентов внеклеточного матрикса (COL1A1, COL1A2) с последующей верификацией отрицательной экспрессии маркеров эндотелиального фенотипа и положительной экспрессии коллагена I типа внутри клеток посредством иммуно-флюоресцентного окрашивания.Цель. На основании случая спонтанного эндотелиально-мезенхимального перехода разработать алгоритм и предложить инструменты для его детекции in vitro.Материалы и методы. В эксперимент включены две серии первичных эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC): первая серия – классический эндотелиальный морфотип, вторая – спонтанно подвергшиеся эндотелиально-мезенхимальному переходу. В качестве отрицательного контроля (клетки с эндотелиальным морфотипом) также использованы первичные эндотелиальные клетки коронарной артерии человека (HCAEC) и первичные эндотелиальные клетки внутренней грудной артерии человека (HITAEC). Оценку молекулярного профиля клеток проводили методами количественной полимеразной цепной реакции после обратной транскрипции, иммуноблоттинга и иммунофлюоресцентного окрашивания с последующей конфокальной микроскопией.Результаты. В отличие от HUVEC с физиологическим профилем молекулярной экспрессии, а также артериальных эндотелиальных клеток HUVEC в состоянии эндотелиально-мезенхимального перехода характеризовались потерей экспрессии генов маркеров и транскрипционных факторов эндотелиальной дифференцировки  (PECAM1,  CDH5,  VWF,  ERG),  многократно  повышенной экспрессией генов двух транскрипционных факторов перехода (SNAI2, TWIST1), приобретением экспрессии генов маркеров клеток мезенхимального ряда (FAP, S100A4, ACTA2) и генов маркеров активности синтеза компонентов внеклеточного матрикса (COL1A1, COL1A2) при сохраненной экспрессии генов общесосудистых маркеров (HES1, NRP1). Отсутствие экспрессии генов специфичных сократительных маркеров (тяжелой цепи миозина гладких мышц (MYH11) и смузелина (SMTN)) в сочетании с приобретенной экспрессией гена менее специфичного сократительного маркера альфа-актина гладких мышц (ACTA2) свидетельствовало о фенотипической схожести трансформированных клеток с миофибробластами, а не c сосудистыми гладкомышечными клетками сократительного фенотипа. Анализ белковой экспрессии методом иммуноблоттинга подтвердил потерю экспрессии эндотелиальных маркеров (CD31/PECAM1, VE-кадгерин/CDH5, ERG) и продемонстрировал сохранность экспрессии вышеуказанных общесосудистых маркеров. Отсутствие иммунофлюоресцентного свечения эндотелиальных маркеров (CD31/PECAM-1, VE-кадгерина, транскрипционного фактора ERG) в сочетании с интенсивным внутриклеточным свечением основного синтезируемого белка межклеточного матрикса – коллагена I типа – также подтвердило реализацию транскрипционной программы эндотелиально-мезенхимального перехода.Заключение. Алгоритм оценки эндотелиально-мезенхимального перехода подразумевает измерение экспрессии генов PECAM1, CDH5, VWF, ERG, SNAI2, TWIST1, FAP, S100A4, ACTA2, COL1A1 и COL1A2, комбинированное с иммунофлюоресцентным окрашиванием на CD31/PECAM-1, VE-кадгерин и транскрипционный фактор ERG в сочетании с окрашиванием на коллаген I типа.