Статья
ЗАСЕЛЕНИЕ ДЕМИНЕРАЛИЗОВАННОГО КОСТНОГО МАТРИКСА КЛЕТКАМИ ХОНДРОГЕННОГО РЯДА
Цель Поиск эффективных способов обработки деминерализованной костной ткани после консервации для эффективного заселения хондроцитами. Материалы и методы В качестве материала исследования использовали деминерализованный костный матрикс размером 1 х 1 х 1 см³. Для удаления цитотоксических веществ из матриц разработан способ очистки, заключающийся в поэтапном замачивании образца в Н2О, растворе 0,1 Н NaOH, растворе 1 н NaOH, Н2О и DPBS до нейтрального pH. Для улучшения клеточной адгезии на матрицах, на последние перед заселением воздействовали ультразвуком. На образец, прошедший химическую очистку 3 раза, воздействовали ультразвуком в течение 1 минуты и W = 5. После каждого воздействия, воду в емкости меняли. После этого воду в емкости сменили на DPBS и обрабатывали ультразвуком в течение 1 минуты и W = 5. После окончания процедур образец находился в нейтральной среде (pH 7,0). Обработанные таким способом матрицы заселяли клетками. В качестве источника клеток для заселения, была выбрана ткань гиалинового хряща мини-поросенка. Хондроциты выделяли стандартным способом с применением коллагеназы II типа и культивировали в течение 20 суток в культуральных флаконах. Матрицы заселяли хондроцитами 1 пассажа. Для повышения эффективности заселения костного матрикса клетками был апробирован способ предварительной обработки деминерализованной костной ткани 1% раствором желатина. Для определения пригодности матрикса к заселению его хондроцитами использовали микротитрационный тест влияния экстракта, получаемого в ходе ультразвуковой обработки матрицы, на жизнеспособность клеток. Тест проводили на лаг- и лог-фазах роста клеток. Воздействие экстракта на клетки длилось 3 суток. Результаты Показано, что обработка хондроцитов экстрактом на этапе лаг-фазы роста культуры оказывает прямой дозозависимый цитотоксический эффект, в отличие от эффекта обработки хондроцитов в фазе логарифмического роста культуры. Показано, что низкая эффективность заселения деминерализованного костного матрикса связана не только с жесткими условиями изготовления ДКМ, но и от условий последующей подготовки матрицы, фазы роста заселяемой клеточной культуры. С увеличением глубины миграции клеток вглубь матрицы нарушается микроциркуляция, что ведет к недостаточному обеспечению клеток в тканеинженерной конструкции питанием и замедлению метаболических процессов. Заключение Эффективность равномерного заселения деминерализованного костного матрикса клетками связана не только с условиями обработки матрикса, выраженным цитотоксическим эффектом, но и с его архитектоникой. Проблема замедления метаболизма клеток в тканеинженерной конструкции решается путем комбинированного метода очистки ДКМ химическим и ультразвуковым способом. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости применении механических и электрических стимулов для нормального функционирования клеток костной и хрящевой ткани внутри матрицы.
